Um bemmicroscópiodeve ter três características:
Boa Resolução: A capacidade de resolução refere-se à capacidade de produzir imagens separadas de objetos próximos, de modo que possam ser distinguidos como duas entidades separadas. Resolução:
Aproximadamente 0,2 mm (200μm) a olho nu
O microscópio óptico tem cerca de 0,2μm
A microscopia eletrônica tem cerca de 0,5 nm
. A resolução depende do índice de refração. O óleo tem um índice de refração mais alto que o ar.
Bom contraste: pode ser melhorado através da coloração da amostra.
Boa ampliação: Isto é conseguido usando lentes côncavas.
Microscopia de campo claro ou óptica
A microscopia de campo claro ou de luz produz imagens escuras contra um fundo mais claro.
microscopia de campo escuro
Princípio: Na microscopia de campo escuro, os objetos parecem brilhantes contra um fundo escuro. Isto pode ser conseguido usando condensadores especiais de campo escuro.
Aplicações: Usado para identificar células viáveis e não coradas e bactérias finas, como espiroquetas, que não podem ser observadas por microscopia óptica.
microscópio de contraste de fase
Ele visualiza células vivas criando diferenças de contraste entre as células e a água. Ele converte diferenças sutis no índice de refração e na densidade celular em alterações facilmente detectáveis na intensidade da luz.
Útil para estudar:
movimento microbiano
Determine a forma das células vivas
Detecte componentes bacterianos, como endósporos e corpos de inclusão.
Microscópio de fluorescência
Como funciona: Quando os corantes fluorescentes são expostos à luz ultravioleta (UV), eles são excitados e fluorescem, ou seja, convertem esse raio invisível de comprimento de onda curto em luz de comprimento de onda mais longo (luz visível).
Aplicações: A microscopia de epifluorescência tem as seguintes aplicações:
Autofluoresce quando colocado sob luz UV, como ciclosporina
Microrganismos revestidos com corantes fluorescentes, como laranja de atriol para parasitas da malária (QBC) e aurinol para Mycobacterium tuberculosis.
Imunofluorescência: Utiliza anticorpos marcados com corantes fluorescentes para detectar antígenos de superfície celular ou anticorpos que se ligam a antígenos de superfície celular. Existem três tipos: IF direto, IF indireto e citometria de fluxo.
microscópio eletrônico
Foi inventado por Ernst Ruska em 1931. Difere da microscopia óptica de uma maneira diferente.
Existem dois tipos de EM:
Transmissão EM (tipo MC, examina a estrutura interna, resolução 0,5 nm, fornece uma visão bidimensional)
Scanning EM (examina a superfície com uma resolução de 7 nm, fornecendo uma visão 3D)
Princípios da microscopia eletrônica de transmissão
Preparação de amostras: Execute as seguintes etapas nas células para preparar amostras muito finas (20 a 100 nm de espessura)
Fixação: Fixe as células usando glutaraldeído ou tetróxido para estabilizá-las.
Desidratação: A amostra é então desidratada usando um solvente orgânico como acetona ou etanol.
Incorporação: A amostra é incorporada em um polímero plástico, que então endurece para formar uma massa sólida. A maioria dos polímeros plásticos são insolúveis em água. Portanto, as amostras devem ser completamente desidratadas antes da incorporação.
Seccionamento: A amostra é então cortada em seções finas com um ultramicrótomo e as seções são montadas em lâminas de metal (cobre).
Técnica de congelamento: Este é um método alternativo para visualizar organelas dentro das células para preparação de amostras.
As células são rapidamente congeladas e depois aquecidas → rompidas com uma faca para expor as organelas internas → sublimadas → cobertas com revestimentos de platina e carbono.
As medidas para melhorar o contraste EM incluem:
Coloração com soluções de sais de metais pesados, como citrato de chumbo e acetato de uranila
Coloração negativa com metais pesados, como ácido fosfotúngstico ou acetato de uranila.
Sombreamento: A amostra é revestida com uma fina película de platina ou outro metal pesado em um ângulo de 45 graus para que o metal atinja os microrganismos apenas de um lado.
